石蠟切片免疫組化步驟
　　BY 月夕
　　鑒于各位第一次入實(shí)驗(yàn)室的同學(xué)，如果沒(méi)有師兄師姐帶教，會(huì)對(duì)具體實(shí)驗(yàn)操作不熟悉，故現(xiàn)在特意撰寫(xiě)一個(gè)實(shí)用的石蠟切片免疫組化詳細(xì)操作經(jīng)過(guò)，一步步教你，新手可以參考一下這個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟。

　　進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室前需要準(zhǔn)備的東西（也就是要向試劑商購(gòu)買(mǎi)的實(shí)驗(yàn)試劑和用品）：
　　1.石蠟切片，也就是你的標(biāo)本，這個(gè)不用我說(shuō)了吧，我們是自己取了標(biāo)本找病理科幫忙制作的，有條件的可以自己包埋自己切片。
　　2.你準(zhǔn)備測(cè)定研究的抗原對(duì)應(yīng)的抗體，如NF-kB抗體、TLR4抗體，購(gòu)買(mǎi)哪家的抗體自己根據(jù)實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)選擇，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中購(gòu)買(mǎi)的是AB-Cam公司的NF-kB 抗體，這是最好的抗體，效果很不錯(cuò)。
　　3.石蠟切片免疫組化試劑盒，有兩步法和三步法兩種試劑盒可供選擇，具體可以詢問(wèn)實(shí)驗(yàn)室的師兄師姐哪個(gè)好，我們實(shí)驗(yàn)中購(gòu)買(mǎi)的是三步法的試劑盒，其中包括雙氧水一瓶（這個(gè)我們自己配雙氧水的，所以實(shí)驗(yàn)過(guò)程中沒(méi)用到）、山羊封閉血清一瓶（即下述實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的A試劑）、二抗一瓶（B試劑）、辣根過(guò)氧化物酶液一瓶（C試劑）。
　　4.DAB顯色試劑盒：包括A液、B液、C液。
　　選購(gòu)上述實(shí)驗(yàn)試劑后可以要求試劑商贈(zèng)送計(jì)時(shí)器（實(shí)驗(yàn)中的操作時(shí)間均要用計(jì)時(shí)器計(jì)時(shí)）、馬克筆、切片盒（用來(lái)裝你們的石蠟切片）、蓋玻片（實(shí)驗(yàn)完后封片用）。
　　5.手套、口罩（實(shí)驗(yàn)過(guò)程中接觸二甲苯、EDTA等有毒物質(zhì)時(shí)給自己防護(hù)）。
　　6.槍頭、EP管（這個(gè)可以讓試劑商送，有的不肯送的就自己買(mǎi)吧，每次用量不是很大，可以小中大號(hào)槍頭各買(mǎi)一包，最小號(hào)EP管用來(lái)分裝抗體和配抗體用，大號(hào)EP管用來(lái)配DAB顯色劑用）。
　　7.移液槍（這個(gè)比較貴，實(shí)驗(yàn)中需用到2.5μL的配抗體，1000μL的配DAB顯色劑，50μL的滴加抗體，槍比較貴，如果實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)充足可自己買(mǎi)，買(mǎi)不起的各種規(guī)格的槍可以向?qū)嶒?yàn)室的其他同學(xué)借，反正用起來(lái)很快的）。

　　下面是具體的實(shí)驗(yàn)步驟，一共分為兩天（實(shí)驗(yàn)中涉及的具體試劑配制法統(tǒng)一見(jiàn)步驟末尾）：
　　第一天
　　1、脫水
　　(1)、65℃烤箱干烤30min。（具體時(shí)間視切片大小多少可調(diào)整，一般不要超過(guò)1h，否則容易脫片）
　　(2)、二甲苯Ⅰ中15min，之后二甲苯Ⅱ中15min。
　　(3)、在無(wú)水乙醇Ⅰ，無(wú)水乙醇Ⅱ，95%酒精，80%酒精，70%酒精中分別浸泡各5min。（2、3這兩步都是跑缸的，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該有專門(mén)的缸，直接放里面就行了）
　　(4)、雙蒸水浸泡5min
　　2、微波修復(fù)抗原：將切片浸入pH6.0，0.01M枸櫞酸修復(fù)液中（配制方法見(jiàn)步驟末尾），電爐或微波爐加熱至92至98℃，持續(xù)15min（注意不要煮沸）。冷卻后（不能人工降溫，不能在冷卻前將切片從熱水中取出）進(jìn)行下一步。
　　對(duì)于這一步，首先配制好抗原修復(fù)液（根據(jù)你的抗原在胞質(zhì)還是胞核表達(dá)而不同，胞質(zhì)的選用枸櫞酸修復(fù)液，胞核的選用EDTA修復(fù)，EDTA在此暫不做詳細(xì)說(shuō)明），接著將雙蒸水中浸泡后的切片放入修復(fù)液中，拿至微波爐加熱修復(fù)，在此我僅述我們的修復(fù)過(guò)程以供參考。
　　修復(fù)液盒子外面另外放一盛水的盒子，防止修復(fù)液沸騰蒸發(fā)，首先高火烤8分鐘（具體時(shí)間視切片多少調(diào)整），發(fā)現(xiàn)修復(fù)液沸騰后立刻停止，如果未沸騰再繼續(xù)延長(zhǎng)烤時(shí)間，結(jié)束后等待1min，接著中火烤1min30s，停1分鐘，再中火烤1min30s，停1分鐘，如此循環(huán)共計(jì)30分鐘，結(jié)束后將整個(gè)裝有抗原修復(fù)液和切片的盒子擺到陰涼處自然晾干，晾干后再進(jìn)行下一步。
　　3、室溫下PBS洗滌5min×3次。（切片全部浸泡在玻璃缸中加入PBS液放入搖床，5min后取出傾去液體，重新加PBS，如此洗滌3次）
　　4、3%雙氧水室溫孵育15min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。
　　5、室溫下PBS洗滌5min×3次。（見(jiàn)第3步說(shuō)明）
　　6、封閉：滴加正常羊血清封閉液（A試劑），37℃孵育30min（具體時(shí)間長(zhǎng)短視情況而定，時(shí)間太長(zhǎng)可能導(dǎo)致特異性抗體也被封閉，做不出結(jié)果來(lái)）。甩去多余的液體，不沖洗。
　　7、滴加適當(dāng)稀釋的一抗(抗體用PBS稀釋，具體稀釋濃度見(jiàn)抗體說(shuō)明書(shū)，一般剛開(kāi)始做的時(shí)候多試驗(yàn)幾個(gè)濃度，如1:50,1:100,1:150等，以尋找出效果最好的抗體稀釋濃度)，4℃過(guò)夜，我們一般是將切片擺到底下盛有水的濕盒中放入4℃冰箱過(guò)夜。（舉例1:100稀釋方法：99μL的PBS中加入1μL的抗體。）
　　這步昨晚之后你就可以回去了，等第二天來(lái)繼續(xù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程，或者你可以先配制一下第二天需要用到的實(shí)驗(yàn)試劑，如PBST。
　　第二天
　　8、取出昨天過(guò)夜的濕盒，37度復(fù)溫30min，PBST沖洗5min×3次。
　　9、滴加生物素標(biāo)記山羊抗小鼠/兔IgG（B試劑），37 ℃孵育30 min。
　　10、PBST沖洗5minX3次。
　　11、滴加適量的辣根酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液（C試劑），37 ℃孵育30 min。
　　12、PBST 沖洗，5min×3次。
　　13、DAB顯色：滴加顯色液，室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，一般在3至10min之間。反應(yīng)至顯微鏡下可見(jiàn)棕褐色顆粒為止，蒸餾水終止反應(yīng)，并用蒸餾水洗滌。顯色前先準(zhǔn)備好雙蒸水，切片從顯微鏡上拿下來(lái)后直接入水中。
　　14、蘇木素復(fù)染。4min后流水沖洗。（蘇木素復(fù)染時(shí)間一般3min即可，視具體情況而定）
　　15、分化：1%鹽酸酒精（實(shí)驗(yàn)室有專門(mén)的缸，不用自備）中浸泡，之后流水沖洗。（分化時(shí)間一般為1-2s，即將切片迅速浸入鹽酸酒精中后迅速提起）
　　16、藍(lán)化：氨水中浸泡30s~1min，之后流水沖洗。我們的藍(lán)化直接是將切片浸入水中浸泡10min就可以了。
　　17、脫水：分別在70%酒精、80%酒精、95%酒精、無(wú)水乙醇Ⅰ，無(wú)水乙醇Ⅱ各3min。（這些實(shí)驗(yàn)室有專門(mén)的缸，不用自備）
　　18、透明：二甲苯Ⅰ，二甲苯Ⅱ中浸泡各10min，晾干。（同上）
　　19、中性樹(shù)脂封片，顯微鏡觀察。（封片可干封也可濕封，濕封即浸泡完二甲苯Ⅱ之后不晾干，切片從二甲苯中撈出后迅速滴加樹(shù)脂蓋上蓋玻片）
　　各種液體配制方法：
　　抗原修復(fù)液中涉及到的液體：
　　A液——枸櫞酸（檸檬酸）5.2525g+雙蒸水250ML（易長(zhǎng)毛，長(zhǎng)毛后需重配）
　　B液——枸櫞酸鈉（檸檬酸鈉）14.705g+雙蒸水500ML
　　抗原修復(fù)液——A液4.5ML+B液20.5ML+雙蒸水225ML
　　3%雙氧水——90ML雙蒸水+30%雙氧水10ML
　　PBS——磷酸氫二鈉14.5g+氯化鈉40g+□□1g+磷酸二氫鉀1g+雙蒸水5L
　　PBST——PBS 2L+（Tween-20） 1ML
　　DAB顯色劑（配制時(shí)請(qǐng)關(guān)燈避光）——1ML雙蒸餾水加入DAB顯色試劑盒中的A液一滴后混勻，再加入B液、C液各一滴混勻即刻，避光保存，30min內(nèi)使用。
　　我這個(gè)過(guò)程講得有夠詳細(xì)了吧，具體的各實(shí)驗(yàn)室肯定有所不同，具體情況具體操作吧，希望對(duì)剛進(jìn)入實(shí)驗(yàn)的同學(xué)能有幫助。
　　最后鳴謝XX大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室四樓~

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